Системы для электрофореза, детекции и блоттинга компании VWR — лучшее оборудование для вашей лаборатории

Блоттинг — это совокупность методик, используемых в области молекулярного анализа, объединенных тем, что все они занимаются переносом каких-то конкретных биомолекул из растворов, содержащих другие молекулы, на тот или иной вид носителя для их изучения. Носителями могут быть нитроцеллюлозные, фторопластовые, нейлоновые или другие мембраны. При этом, биомолекулы могут подвергаться гель-электрофорезу или переноситься сразу на мембраны.

Следующим после блоттинга этапом обычно является визуализация молекул посредством окрашивания (это может быть серебрение белков и др.), авторадиографической визуализации или специфического маркирования с использованием иммунохимических или гибридизирующих методик. С момента своего открытия (1979 г.) и по сей день блоттинг — обязательный инструмент всех молекулярных и других исследовательских лабораторий. Это классический метод для поиска белковых составляющих с низкой концентрацией в сложных по составу образцах, а также для изучения экспрессии белковых молекул и для очистки их смесей от примесей. Методик блоттинга достаточно много. Самая примитивная из них — простая процедура, известная как дот-или слот-блот, в которой перенос белков на микропористые мембраны производится посредством вакуумной фильтрации.

Методика достаточно информативна, когда речь касается общего уровня экспрессии белка, более того, ее можно проводить одновременно на целом ряде образцов, однако о молекулярной массе исследуемых биомолекул она информировать не в состоянии. Да и специфичность у нее весьма спорная, потому что наряду с интактными белковыми молекулами она обнаруживает и поврежденные, разлагающиеся, а также модифицированные изоформы.

В настоящее время разработано огромное множество других методик блоттинга.

Основной их классификацией считается классификация по исследуемым образцам. Согласно ей выделяют:

• Саузерн-блоттинг (определяет последовательность нуклеотидов дезоксирибонуклениновых кислот);
• Соузвестерн-блоттинг (определяет белковые молекулы, связанные с дезоксирибонуклениновыми кислотами);
• Нозерн-блоттинг (определяет последовательности рибонуклеиновых кислот);
• Вестерн-блоттинг (определяет специфичные белки);
• Истерн-блоттинг (определяет посттрансляционные модификации белковых молекул).

Наиболее часто в настоящее время используется вестерн-блоттинг (иммуноблотинг). Этот метод обладает высокой чувствительностью и используется для обнаружения специфических белков с помощью реакции антиген-антитело. Метод достаточно сложен с технической точки зрения и заключается в разделении смесей белковых молекул с использованием одной из разновидностей ионофореза — гель-электрофореза с их последующей электродиффузией на какую-либо из подходящих для этого мембран (чаще всего материалом такой мембраны является поливинилиденфторид — полимер винилиденфторида.).

По окончанию электродиффузии белковых молекул на мембрану, их обычно окрашивают для визуализации и идентифицируют при помощи иммунологического или масс-спектрометрометрического анализа, методов секвенирования нового поколения и т.д. Иммунодетекция представляет собой идентификацию белковой молекулы посредством ее реакции с комплиментарным ей антителом.

Благодаря пространственному разрешению иммуноблоттинг способен снабдить исследователей такой информацией, как молекулярная масса каких-то конкретных белков, наличие изоформ, промежуточных продуктов, и других посттрансляционно модифицированных форм. Вестерн-блоттинг показал себя как высокоэффективный и точным метод во многих медицинских областях, это диагностика инфекций, аутоиммунных, аллергических заболеваний и многое другое. Иммноблоттинг, известный своей надежностью диагностический тест, часто используемый для верификации повторных реактивных результатов иммуноферментного анализа в случаях вирусных инфекций, это не допускающий сомнений, чрезвычайно чувствительный и одновременно достаточно простой анализ, гарантирующий получение комплексной и достоверной информации. Примерами использования данного метода служат исследование экспрессии белковых молекул в дрожжах, подсчет белковых реплик и компартментализация, исследование конкурентного подавления протеинкиназ аденозинтрифосфорной кислоты, выявление генно-модифицированных объектов (организмы, культуры, продукты). Иммноблоттинг также является базой для новаторских исследований, он — стандарт оценивания методов обнаружения антител и белков (например, ИФА, проточных цитометрии и иммуногистохимии, анализа на базе сферических гранул и т.д.).

Высокая степень разрешения иммуноблоттинга (при оптимальных условиях метод позволяет зафиксировать количество белка не превышающее 1 нг) обусловлена электрофоретическим разделением белковых молекул и специфичностью моно- и поликлональных антител.

Вестерн-блоттинг проводится в несколько этапов:

Первый этап — электрофорез белков на полиакриламидном геле в присутствии натриевой соли лаурилсерной кислоты — додецилсульфата натрия (sodium dodecyl sulfate — SDS), или SDS-электрофорез. Присутствие додецилсульфата натрия заставляет исследуемые белковые молекулы приобретать одинаково отрицательные заряды, это позволяет разделять их по молекулярным массам. Миграция белков, подвергшихся денатурации сквозь акриламидную гелевую массу к аноду (под действием электрополя), подчиняется определенным правилам — более мелкие молекулы движутся с большей скоростью, чем более крупные. При этом, гелевая масса маркирована (маркерами служат нативные или рекомбинантные белки, чьи молекулярные массы известны). Из-за того, что скорость продвижения (электрофоретическая подвижность) у разных белков различная, появляется распределение белков по полосам.

Вторым этапов является электродиффузия белковых молекул из гелевой массы на мембраны. Итогом данного процесса является попадание белков на поверхность мембраны, и в этом тончайшем поверхностном слое мембраны происходит их связывание с ней посредством гидрофобных и электростатических связей. Что важно, белковые молекулы диффундируют на поверхность мембраны в той же последовательности, которую они имели в геле. Поэтому на мембране появляется реплика геля с белковыми молекулами, следующими друг за другом точно также, как и в гелевом субстрате.

Третьим этапом Вестерн-блоттинга является блокирование. В целях предотвращения неспецифического связывания антител с материалом мембраны, ее подвергают инкубированию в слабо концентрированном белковом растворе белка (чаще всего для приготовления растворов используются сывороточные альбумины крупнорогатого скота или обезжиренный молочный порошок). Белковые молекулы из таких разбавленных растворов сцепляются со свободными от полос белка участками. Благодаря данному процессу после добавления антител происходит их связывание исключительно с исследуемыми белками. Данный этап блоттинга обеспечивает чистоту фона и исключает ложноположительные результаты.

Четвертый этап заключается в связывании исследуемых белковых молекул с антителами. После завершения третьего этапа мембрана трехкратно промывается буферным раствором, затем приступают к ее последовательной инкубации с несколькими видами антител с использованием метода «сэндвича»: в начале белковые молекулы взаимодействуют с первичными антителами, потом происходит связывание последних с вторичными, которые конъюгированны с ферментами (это может быть пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза).

И пятый, последний, этап блоттинга — детекция. Он является визуализацией исследуемых белков посредством подходящей биохимической реакции, продукт которой затем определяется колориметрическими, хемилюминесцентными или флюоресцентными методами. Количественная оценка содержания белка производится с использованием денситометрии.

Методики блоттинга постоянно совершенствуются из-за повышения требований к их уровню чувствительности, например, это актуально при анализе нескольких белков одновременно (для оценки сложных сетей, когда нужно сохранить ценные образцы). Такой улучшенной методикой является «двойной блоттинг», способный исключить ложноположительные результаты реакций из-за неспецифических взаимодействий белков с пулом несвязанных вторичных антител. Фар-вестерн блоттинг обнаруживает специфические взаимодействия «белок-белок», сауз-вестерн идентифицирует белковые молекулы, связывающиеся со специфическими последовательностями дезоксирибонуклеиновой кислоты. Многополосная разновидность вестерн-блоттинга улучшает пропускную способность при уменьшении вариабельности между блотами. Инновационные методики блоттинга позволяют снизить уровень минимального содержания для появления сигнала белковых молекул и поэтому способны значительно улучшить количественную эффективность блоттинга.

Но для проведения данных видов блоттинга нужно специальное, высококлассное оборудование, современные системы для блоттинга. К такому оборудованию предъявляются максимально строгие требования. Например, очень важен тип мембраны, которая будет использоваться для блоттинга. И при выборе мембран должен учитываться целый ряд параметров. Насколько хорошо они будут связываться с белками? Не повредит ли их увлажнение спиртом? Можно ли их подвергать многократной очистке и использовать повторно? Насколько хорошо на них проходит визуализация белков? Как долго на них могут сохраняться блотты? Насколько четкое соотношение сигнал/фон? Все эти вопросы обязательно задаются производителями оборудования и исследователями, которые его приобретают.

Поливинилиденфторидные и нитроцеллюлозные мембраны — самые распространенные виды мембран для вестерн-блоттинга, притом, поливинилиденфторид более предпочтителен в электроблоттинге, чем нитроцеллюлоза — у них выше физическая устойчивость и шире спектр химической совместимости. Высокий уровень механической прочности и великолепная химическая толерантность превратила PVDF-мембраны в идеальный инструмент иммунодетекции (они выдерживают разнообразные виды окрашивании и подходят для проведения повторных исследований). Вторым плюсом PVDF-мембран является относительная универсальность применения повторных полос (их можно окрасить красителем, потом вырезать и провести N-концевое секвенирование, протеолиз или разделение с помощью внутреннего секвенирования, а также иммунодетекцию).

Средней связывающей способностью самых распространенных мембран из целлюлозы является уровень в пределах 80–100 мкг/см², а у мембран из поливинилиденфторида этот показатель равен 100-200 мкг/cм². Более высокая эффективность PVDF в сравнении с нитроцеллюлозой доказана в процессе их использования. Например, выявление АГ вируса иммунодефицита человека в сыворотке доказало, что суммарные антигены данного вируса на удерживаются на них значительно лучше, а процент обнаружения АТ к гликозилированным К-антигенам ощутимо выше. Одним из немногих недостатков работы с поливинилиденфторидом является необходимость его специальной обработки в процессе проведения блоттинга. Поливинилиденфторид — гидрофобное вещество и для работы с водными растворами такие мембраны нуждаются в смачивании в большом количестве спиртового раствора (раствор метанола, этанола или изопропанола). Затем для удаления спирта из мембраны ее обильно промывают водой, и только потом уравновешивают в буфере.

Факторов, влияющих на успешность переноса белков несколько. Это и додецилсульфат натрия, и правильность подбора электрического тока и времени переноса (недостаточность того или другого ведут к неполноте переноса, а избыток силы тока приведет к тому, что белок не будет успевать адсорбироваться), и рН буфера для переноса (при равенстве изоэлектрической точки белка рН буферного раствора, перенос не возможен, поэтому используются буферные растворы с высокими показателями рН, например, CAPS, или с низкими — разведенная уксусная кислота), и время уравновешивания (раньше гели уравновешивались около получаса, затем системы стали требовать более длительного уравновешивания для стабилизации размера геля, и, наконец, по приходу эры мини-гелей, время уравновешивания опять сокращено).

Для качественного проведения всех этапов блоттинга необходимо специальное оборудование: камеры для электропереноса (фореза), аппараты для полусухого переноса, мембраны (блоты и двойные блоты), гидрофильные PVDF-мембраны, аппаратура для флуоресцентной съемки, неглубокие планшеты, стеклянные пластины, пакеты для замораживания, пленки и кассеты для авторадиографии, устройства для обрабатывания авторадиографических пленок, источники вакуума (насосы или другие стандартные источники, гарантирующие получени устойчивого минимального давления в 410 миллибар и 34 л/ мин), вакуумные центрифуги и пробирки для них, MALDI-TOF матрицы и т.д.

И здесь мы предлагаем вашему вниманию системы для блоттинга VWR. Компания VWR — мировой лидер по продаже качественных и надежных приборов для научных и медицинских исследования.

Оборудование для электрофореза и детекции VWR collection — это лабораторное оборудование высочайшего класса: точное, эффективное и максимально надежное. Компания имеет представительство в Москве. Мы осуществляем доставку систем для блоттинга по всей России, осуществляем сервисный ремонт и полное техническое обслуживание. Делайте заказ, покупка оборудования у нас — быстрый, безопасный и выгодный процесс.