Термоциклеры для амплификации образцов ДНК и РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Амплификаторы (ДНК-циклеры, термоциклеры, ПЦР-машины) являются приборами, обеспечивающими сверхточный (не менее 0,1 °C) переход от периодов охлаждения до периодов нагрева пробирок и используемыми в молекулярно-биологическом исследовании для амплификации ДНК посредством ПЦР. Термоциклеры способны задать необходимое число циклов, выбрать максимально подходящие временные и температурные интервалы любой из процедур цикла. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является основным методом получения генов, который базируется на способности ДНК-полимеразы образовывать вторую цепочку ДНК, используя для этого комплементарную цепочку, повторяя процесс репликации ДНК, происходящий в живой клетке. Начало репликации в ПЦР задают два небольших фрагментов ДНК (затравки, или праймеры), комплементарные концам реплицируемого гена на обоих нитях ДНК. В начале ДНК хромосомы с интересующим геном нужно смешать с праймерами и нагреть до 94–99 °С с целью достижения разрыва связей водорода и расхождения ДНК-цепей. Это этап называется денатурацией.
Затем начинается этап присоединения, или отжига праймеров, он проходит при температуре от 40 до 75 °С. Праймер, или затравка — это прицельно выбранный ограниченный фрагмент ДНК, комплементарно соответствующий изучаемому отрезку ДНК-матрицы. Итак, температура понижается до 40–75 °С (на уровень выставляемой температуры влияет длина и последовательность праймеров). Такие условия обеспечивают соединение затравок с комплементарными участками хромосомной ДНК, и образуется правильная двойная спираль.
Потом начинается следующий этап, этап элонгации ДНК, или синтеза новой цепочки ДНК, он проходит при температуре 60–75 °С. Для его осуществления добавляются четыре необходимых для синтеза нити ДНК нуклеотида и ДНК-полимераза. Благодаря последней праймеры удлиняются, строится двуспиральная ДНК от локуса крепления праймеров (концы гена) до окончания цепи хромосомной ДНК. При повторном нагревании в этой смеси будет снова наблюдаться расхождение цепей, тех, что были синтезированы, а при повторном охлаждении и добавлении праймеров вновь начнется синтез, но на этот раз с противоположной стороны, т.е. будет построена первоначальная последовательность, как в гене. Повторяя вновь и вновь нагрев и охлаждение в том же духе, можно удвоить количество нужных последовательностей (они ограничены с обоих концов введенными праймерами) в каждом из циклов. 25 подобных циклов увеличивает количество копий гена примерно в миллион раз. И этого объема хромосомной ДНК вполне достаточно для исследования. Обычно в исследованиях используют от 20 до 40 циклических процессов. Посредством ПЦР, при использовании исходного образца в качестве матрицы, можно получить большое количество копий гена in vitro, повысив в пробе содержание нужной последовательности более чем стократно.
ДНК-амплификаторы или термоциклеры представляют собой программируемые термостатирующие устройства, способные циклически повторять свою программу работы. Самыми важными функциональными показателями приборов, которые напрямую изменяют скорость полимеразной цепной реакции и ее качество, стали скорость линейного изменения и уровень точности выставленных температур. Основу конструкции любого циклера составляют термоблок и термостатирующая и управляющая системы. Первый закрепляет в неподвижном состоянии набор используемых реакционных сосудов (обычно это пробирки из медицинского пластика объемом 0,2 миллилитра) и обеспечивает теплопередачу. Кроме отдельно стоящих пробирок, могут использоваться стрипы по 8 шт. и 96-луночные планшеты.
Термоблоки бывают твердотельными или роторными. Первые используются чаще, они выполнены из сплава с высоким уровнем теплопроводности и имеют специальные углубления для реакционной посуды, роторные же просто закрепляют пробирки неподвижно и термостатирование осуществляют исключительно воздушное. Для оценки работы термоблоков используют такие параметры, как уровень теплопроводности (он должен быть высоким) и степень однородности температур (в современных приборах этот показатель достигает 0,1 °C). Важным критерием оценки качества термоблока является наличие нагреваемой крышки (оснащение крышки нагревательным элементом). «Горячая крышка» предотвращает выпаривание рабочей жидкости. Крышка может быть откидной, либо внутренней, когда термоблок выдвигается наподобие DVD-привода. В устройствах, где «горячая крышка» отсутствует (они устарели) для этих целей на реакционную смесь наносится один из видов минерального масла. Термостатирующая система в термоциклерах последних генераций — это элементы Пельтье, радиатор и вентилирующее устройство. Такое строение гарантирует быстроту изменения температур, максимальную независимость от микроклимата окружающей среды. Кроме того, такие системы надежны и компактны благодаря простоте своей конструкции.
Ранее использовавшиеся как термостатирующие системы наборы из водяных бань или твердотельных термоблоков, где каждый температурный «уровень» имел фиксированную температуру, а реакционная посуда переносилась механически, резистивный нагрев и охлаждение воздушными потоками проводилось при этом либо принудительно, либо пассивно.
Система управления современных моделей — это встроенный микрокомпьютер, контролирующий четкую и быструю сменяемость температурных уровней для каждого из этапов амплификации. Пользователи могут осуществлять ввод информации с клавиатуры или с алфавитно-цифрового или графического дисплея. Современные модели премиум уровня оснащены цветными сенсорными экранами с повышенным уровнем разрешения с интерфейсом, подобным интерфейсу мобильных дивайсов, а также расширенным сервисным функционалом. Их можно подключать к ПК, в них предусмотрена возможность ведения журнала работы, а также распечатки данных и т.д.
Современные модели имеют и ряд других полезных функций. Например, Real-Time PCR — с помощью этой функции можно проводить ПЦР в реальном времени, такие приборы оснащены детектирующими флуоресценцию устройствами, реагирующими на флуоресцентный сигнал рабочего раствора. В моделях с твердотельными термоблоками детекция происходит сквозь крышки пробирок, что сможет снижать качество, а в моделях с роторными термоблоками — сквозь дно пробирок, что предпочтительнее.
К другим усовершенствованиям современных амплификаторов относятся оснащение их сменными термоблоками, возможность задания необходимого температурного градиента, оснащение калькулятором температурных режимов (на базе нуклеотидной последовательности праймеров), электрифицированное открывание крышки термоблока, голосовое управление и др.
Наша компания предлагает самое надежное и самое современное оборудование для ПЦР. У нас вы найдете лучшие приборы, лучшие цены на них и лучший сервис. Наши консультанты всегда помогут вам с выбором наиболее подходящего амплификатора.
