Главная  Информация для покупателей  CRISPR -редактирование генов в Т-лимфоцитах открывает новые возможности

CRISPR -редактирование генов в Т-лимфоцитах открывает новые возможности

14 июля 2018


Эффективная, дешевая и точная техника, говорят авторы данного исследования, стала концом долгого пути создания новой клеточной терапии.

Команда ученых создала CRISPR ориентир, в результате чего протеин с зеленой флуоресценцией выражен только в определенных клеточных локализациях и структурах.

Для достижения этих выдающихся для науки, медицины и индустрии результатов, ученые из Калифорнийского Университета (Сан-Франциско) генетически запрограммировали иммунные клетки человека — Т-лимфоциты, используя не вирусы, а вставки ДНК. Ученые утверждают, что ожидают от своей техники быстрого, универсального и экономически достижимого использования технологии CRISPR (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) редактирования генов, которая широко используется в набирающей обороты области клеточной терапии, увеличивая шансы создания новых безопасных методов лечения рака, аутоиммунных и других заболеваний, включая редкие наследственные.

Новый метод, описанный в выпуске журнала «Nature» от 11 июля, предлагает для перезаписи последовательности генома в человеческих Т-лимфоцитах надежную молекулярную систему, работающую по принципу «вырезать и вставить». Он основывается на электропорации, процессе, при котором электрическое поле, примененное к клеткам, временно делает их мембраны более проницаемыми.

После года экспериментирования с тысячами величин, ученые Калифорнийского университета нашли точные количества Т-лимфоцитов, ДНК и CRISPR -ножниц, которые должны быть смешаны друг с другом для последующей их обработки электрическим полем, чтобы Т-лимфоцит смог получить из этих составляющих все необходимое, для точного интегрирования своего генома со специфической генной последовательностью, ьььюэхз.разработанной CRISPR-программой. «Это быстрый и легко приспосабливаемый к различным условиям метод, который может применяться для изменения, повышения функциональной активности и репрограммирования Т-клеток, поэтому мы может наделить их специфичностью, которая нам нужна для разрушения раковых клеток, для распознавания инфекций, а также для подавления чрезмерного иммунного ответа, наблюдаемого при аутоиммунных заболеваниях. Сейчас мы находимся у финишной ленты на всех этих фронтах», — сказал Алекс Марсон, доктор медицинских наук, доцент микробиологии и иммунологии, член центра исследования рака Хелен Диллер Калифорнийского университета и ведущий автор данного исследования.

Важны не столько скорость и простота использования новой технологии, сказал Марсон (который, кроме всего перечисленного выше, является научным руководителем центра биомедицины в Инновационном институте геномики), сколько то, что этот подход позволяет вставлять в Т-лимфоциты значительные участки ДНК, которые могут наделять клетки новыми мощными способностями. Сотрудники лаборатории Марсона уже имели до этого положительные результаты использования электропорации и CRISPR для закладывания частичек генетического материала в Т-лимфоциты, но до сегодняшнего момента все многочисленные попытки ученых разместить длинную последовательность ДНК внутрь Т-клеток приводили к их гибели, что заставляло думать, что длинные ДНК-последовательности высоко токсичны для лимфоцитов. Демонстрируя универсальность и эффективность нового метода, исследователи использовали его для исправления болезнетворных генетических мутаций в Т-лимфоцитах детей с редкими наследственными аутоиммунными заболеваниями, а также для создания Т-клеток, способных обнаруживать и уничтожать клетки меланомы человека. Вирусы вызывают инфекции инъецируя свой генетический материал через клеточные мембраны, и с 1970-х годов ученые использовали эту их способность, удаляя у вирусов вирулентность и используя полученные «вирусные векторы» для переноса ДНК в клетки для исследований, генной терапии, а также, для создания клеток CAR-T, используемых при иммунотерапии рака. Т-клеточная инженерия с использованием вирусов одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США для борьбы с некоторыми типами лейкемии и лимфомы. Но создание вирусных векторов — трудоемкий и дорогостоящий процесс, и это приводит к проблемам, как в лечении генетических заболеваний, так и в клеточно-опосредованной терапии. Но даже если вирусные векторы доступны, они далеки от идеала, потому что для них характерно бессимптомное встраивание генов в клеточный геном, что может вредить здоровым генам или может привести к неподчинению вновь введенных генов регулирующим механизмам, обеспечивающим нормальное функционирование клеток. Эти ограничения, потенциально приводящие к развитию серьезных побочных эффектов, становятся большой проблемой и в генной, и в клеточной терапии, в том числе и в CAR-T-иммунотерапии.

«Попытки внедрить новые гены в Т-клетки продолжались около тридцати лет», — сказал основной автор исследования Тео Рот, научный сотрудник программы Калифорнийского университета Medical Scientist Training, который разработал и провел данное исследование в лаборатории Марсона. «Теперь не нужно будет иметь шесть или семь человек в штате лаборатории, работающей с вирусами, только для того, чтобы спроектировать Т-клетки. Значит, мы увидим сотни лабораторий, занимающихся этими клетками, а не несколько, как это было раньше, и работать они смогут с ДНК-последовательностями все возрастающей сложности. Мы будем создавать как можно больше возможностей для того, чтобы ускорить развитие будущих методик клеточной терапии ».

После приблизительно года проб и ошибок Рот определил пропорции Т-клеточной популяции, количества ДНК и содержания CRISPR, которые взаимодействуя друг с другом и электрическим полем, обладающим определенными параметрами, приведут к эффективному и точному редактированию геномов Т-клеток. Подтверждая обнаруженные данные, Рот заставлял CRISPR категорировать наборы различных протеинов Т-клеток с зеленым флуоресцирующим протеином (GFP — green fluorescent protein), и результат был высокоспецифичным, с минимальным уровнем результатов «мимо цели»: каждый из CRISPR образцов внутриклеточных структур Рота соответствовал маркировке GFP, остальные же под микроскопом зеленым не светились. Затем, в дополнительных экспериментах, служащих доказательством перспективности новой терапевтической техники, Рот, Марсон и их коллеги показали, как она может потенциально использоваться для настройки Т-лимфоцитов против каких-то аутоиммунных заболеваний или рака.

В первом примере Рот и его коллеги использовали Т-клетки, предоставленные в лабораторию Марсона Йельской школой медицины Кевана Герольда. Клетки были получены от трех сибсов (братьев и сестер) с редким и тяжелым аутоиммунным заболеванием, которое до сих пор было устойчивым к лечению. Геномное секвенирование показало, что Т-клетки у этих детей несут мутации в гене IL2RA. Этот ген содержит инструкции для рецептора клеточной поверхности, необходимые для развития регуляторных Т-клеток, контролирующих другие иммунные клетки и предотвращающие аутоиммунитет.

С помощью невирусного метода CRISPR команда Калифорнийского университета смогла быстро восстановить дефект IL2RA в детских Т-клетках и восстановить клеточные сигналы, которые были нарушены мутациями. В CAR-T терапии Т-клетки, которые были удалены из организма, модифицированы для борьбы с раковыми клетками, затем возвращаются в организм для лечения опухолей. Исследователи надеются, что подобный подход может быть эффективным и для лечения аутоиммунных заболеваний, при которых нарушаются регуляторные клетки, таких, как у этих троих детей с мутациями IL2RA.

Во втором наборе экспериментов, проведенных в сотрудничестве с доктором философии Кристиной Пуиг-Саус и Антони Рибасом из Института иммунотерапии рака Паркера в Лос-Анджелесе, ученые полностью заменили рецепторы изначальных Т-клеток в популяции нормальных человеческих Т-клеток новыми рецепторами, которые были специально спроектированы для поиска определенного подтипа клеток меланомы человека. Т-клеточные рецепторы — это датчики, которые клетки используют для обнаружения болезни или инфекции, и, разглядывая контрольные чашки петри можно увидеть, как сконструированные клетки эффективно размещаются в мишенях — клетках меланомы, игнорируя другие клетки, проявляя выраженную специфичность, которая и является основной целью прецизионной медицины рака.

Без необходимости использования вирусов исследователи могут генерировать большое количество CRISPR-модифицированных клеток, перепрограммированных для отображения нового рецептора Т-клеток. При переносе на мышей, с имплантированными в них опухолями меланомы человека, сконструированные человеческие Т-клетки попадали на участок опухоли и проявляли противораковую активность. «Эта стратегия замены Т-клеточного рецептора может быть распространена на любой рецептор Т-клеток», — сказал Марсон. «С помощью этой новой техники мы можем вырезать и вставить в указанное место практически любой ген, переписывая нужную страницу в последовательности генома».

Другая информация

18 октября
Получен новый, простой, но эффективный диод для микроволн

Ученые из Китая и Канады разработали проект и создали диод для микроволновых устройств и квантовых компьютеров.

14 октября
Ученые описали новый фундаментальный тип пространственной изомерии

Eчёные смогли описать новый тип пространственной изомерии, соответствующий молекулам органического типа.

10 октября
Химики создали каркас, способный очистить этилен на 99,99%

По данным статистики, в прошлом году было произведено около 170 млн. тонн этилена. Именно поэтому учёные озаботились тем, чтобы научиться получать быстро максимально очищенный продукт.

07 октября
Российские ученые представили прототип двухкубитного квантового компьютера

Кубиты более универсальны и функциональны, чем биты, поскольку помогают проводить грандиозные вычисления со скоростью на порядок выше ныне существующих.

04 октября
Голубой углерод образуется при участии макроводорослей

После анализа практически 580 образцов морских метагеномов стала известной судьба голубого углерода повсеместно.

Вся информация